【目的和要求】
1.掌握无菌技术,建立无菌观念;明确无菌操作时注意要点。
2.掌握**的接种、分离培养方法和接种环的制作方法。
3.熟悉**生长现象的观察方法。
【试剂与器材】
1.菌种:葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等。
2.培养基:固体、半固体、液体培养基。
3.其他:温箱、酒精灯、接种环、接种针、L形玻棒、打火机、记号笔等。
【实验内容】
一、**的接种工具
1.接种环和接种针:其结构包括环(针)、金属柄、绝缘柄三部分(见图4-1)。其中环(针)部分*佳材料为白金丝,因其受热和散热速度快,硬度适宜,不易生锈且经久耐用,但因为价格昂贵而限制了其应用。目前实验室常用的是经济实用的300~500W电热镍鉻丝。一般要求接种环长5~8cm,直径为2~4mm,定量接种环的容量为0.001ml。
图4-1 接种环和接种针
接种环(针)在使用之前需检查镍鉻丝是否呈直线,若有弯曲,需用吸管或接种环的另一端将其压直;若环不圆,可将镍鉻丝前端放在吸管尖部缠绕一圈,再将镍鉻丝突出的部分朝内压紧。
接种环用于固体、液体培养基的接种,接种针用于半固体培养基的接种。
2.L形玻棒:由直径2~3mm的玻璃棒弯曲成L形制成。在使用之前用厚纸包扎后置高压蒸汽**,或沾取无水乙醇后在火焰上烧灼**。主要用于液体标本涂布接种。
二、**的接种方法
1.液体培养基的接种
该法主要用于**的增菌培养或进行**的生化反应。
方法:(图4-2)
(1)先将接种环在火焰上烧灼**,待冷却后挑取少许**。
(2)左手拿试管,右手持接种环,用右手其余手指将试管塞打开,试管口通过火焰烧灼**。
(3)将接种环在贴近液面的管壁上上下碾磨数次,使**均匀分布于培养基中。
(4)将试管口**后加塞,接种环烧灼**后放回原处。
(5)在试管上做好标记,经35℃培养18~24h后观察结果。
图4-2 液体培养基接种法
2.半固体培养基的接种
该法可用于保存菌种、观察**的动力或进行**的生化反应。
方法:(图4-3)
(1)先将接种针在火焰上烧灼**,待冷却后挑取少许菌落。
(2)左手拿试管,右手持接种针,将试管塞打开后,试管口通过火焰**,将接种针从培养基的中心向下垂直穿刺接种至试管底上方约5mm处(勿穿至管底),然后由原穿刺线退出,
(3)将试管口**后加塞,接种针烧灼**后放回原处。
(4)在试管上做好标记,经35℃培养18~24h后观察结果。
图4-3 半固体培养基接种法
3.平板划线接种法
该法可将标本中的多种**分散成单个菌落,有利于**的分纯和进一步鉴定。
方法:
(1)连续划线法(图4-4)
1)先将接种环在火焰上烧灼**,待冷却后挑取少许菌落。
2)左手斜持平板,用手掌托着平板底部,五指固定平板边缘,在酒精灯旁以拇指、食指和中指将平板盖撑开大约30~45°角,将已挑取**的接种环先在平板一侧边缘均匀涂布,然后运用腕力将接种环在平板上自上而下,来回划线。划线要密,但不能重叠,充分利用平板的面积,不能划破琼脂表面,并注意无菌操作,避免空气中的**污染。
3)划线完毕,将平板扣入平板盖,接种环烧灼**后放回原处。
4)在平板底上做好标记,经35℃培养18~24h后观察结果。
图4-4 固体培养基连续划线法
(2)分区划线法(图4-5)
1)先将接种环在火焰上烧灼**,待冷却后挑取少许菌落。
2)同上法将平板盖打开约30~45°角,将已挑取**的接种环在平板一端(1区)内作来回划线,再在2、3、4区依次划线,每区的划线须有数条线与上区交叉接触,每划完一区是否需要烧灼接种环依标本中的菌量多少而定,每区线间需保持一定距离,线条要密而不重复。
3)划线完毕,将平板扣入平板盖,接种环烧灼**后放回原处。
4)在平板底上做好标记,经35℃培养18~24h后观察结果。
图4-5 固体培养基分区划线法
4.斜面培养基接种法(图4-6)
斜面培养基主要用于**的纯培养,以进一步鉴定**或保存菌种。
(1)将接种环(或接种针)在火焰上烧灼**,待冷却后以无菌操作挑取少许菌落。
(2)左手拿试管,打开试管塞后,试管口通过火焰**,再将取有**的接种环由斜面底部向上划一直线,再由下至上在斜面上作曲线划线。
(3)试管口**后加塞,接种环烧灼**后放回原处。
(4)在试管上做好标记,经35℃培养18~24h后观察结果。
图4-6 斜面培养基接种法
5.涂布接种法
本法主要用于活菌计数和药敏试验。
(1)活菌计数:取一定稀释度的菌液0.1ml滴在平板上,用无菌L型玻璃棒将液滴涂布均匀,盖上平板盖,经35℃培养18~24h后计数菌落,则每毫升所含活菌数=菌落数×10×稀释倍数。
(2)直接涂布法:多用于纸片法和管碟法药敏试验。先配制一定浓度的菌液,用无菌棉签蘸取菌液后,在管壁上将多余的液体挤去,在MH琼脂平板上按三个方向均匀涂布3次,*后沿平板边缘涂一周。盖上平板盖,置室温放置5min使平板表面稍干,然后用无菌镊子将药敏纸片贴在培养基表面,或向竖在平板表面的牛津小杯内加入不同浓度的**,经35℃培养18~24h后观察结果,测定抑菌圈直径,按判断标准判定结果。
6.倾注培养法
此法常用于标本或样品中活菌计数。
(1)方法:
1)将标本用无菌生理盐水稀释成不同浓度:10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等。
2)取不同稀释度的标本各1ml分别注入直径90mm无菌平皿,迅速加入溶化并冷却至约50℃的营养琼脂15ml,轻轻转动平板使之充分混匀,待凝固后翻转平板。
3)置35℃温箱孵育18~24h,计数菌落形成单位(colony forming unit,CFU),按下式算出每ml标本中的**数:
1ml标本中的活菌数=全平板CFU×稀释倍数
7.**接种的注意事项
(1)**接种过程中需注意无菌操作,避免污染,因此每一步操作均需严格按要求进行。操作时不宜说话或将口鼻靠近培养基表面,以免呼吸道排出的**污染培养基。
(2)所有操作均需在酒精灯火焰附近进行,平皿盖、试管塞、瓶塞均应拿在手上打开(具体见前述),禁止将盖或塞事先取下放置在桌面上。
(3)取菌种前灼烧接种针(环)时要将镍鉻丝烧红,烧红的接种针(环)稍事冷却再取菌种,以免烧死菌种。
(4)取菌时注意菌落不要取得太多,应蘸取而不宜刮取,否则平板划线很难分离出单个菌落。
(5)平板划线时注意掌握好划线的力度和角度,用力不能过重,接种环和培养基表面大约呈30~40°角,划线要密而不重复,充分利用培养基,并注意不能划破平板。半固体培养基接种时注意穿刺线要直,并沿原穿刺线退出。
(6)接种完毕后,需在培养基上做好标记再放置温箱孵育。废弃的有菌材料(如玻片、有菌的平板、试管、吸管等)均需**后再清洗。发生有菌材料污染应及时进行**处理。
三、**的培养方法
1.需氧培养法
该法适用于需氧菌和兼性***。将接种后的培养基(试管放试管架上,平板底上盖下)置35℃培养箱,培养18-24h。大多数**生长速度快,在孵育18~24h后即可见到生长现象,但若标本中的菌量少或生长速度慢的**(如结核分支杆菌),则需培养3~7天甚至4~8周后才能观察到生长现象。
2.CO2培养法
(1)CO2孵育箱:能自动调节箱内CO2的浓度和温度,使用方便。
(2)烛缸法:取一有盖磨口标本缸或玻璃干燥器,在盖及磨口处上涂上凡士林。将接种后的培养基放入缸中,并在缸内放一支点燃的蜡烛,加盖密封。随着缸内蜡烛燃烧产生的CO2增加,蜡烛逐渐自行熄灭,此时缸内的CO2浓度约为5~10%,置35℃培养箱孵育18~24h后观察结果。(见图4-7)
图4-7 烛缸法
(3)化学法(重碳酸钠-盐酸法):按每升容积重碳酸钠0.4g与1mol/L盐酸0.35ml比例,分别将二种试剂置于容器内,将容器放置在标本缸中,密封后倾斜容器,使二种试剂接触混合产生CO2。该法适用于奈瑟菌和布鲁菌等苛养菌的培养。
3.微需氧培养:先用真空泵将容器内的空气排尽,再注入5%O2、10%CO2、85%N2的混合气体,然后置于35℃培养箱孵育后观察结果。该法适用于空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等微需氧菌的分离培养。
4.厌氧培养法:
(1)厌氧罐培养法:用理化方法使容器内形成无氧环境,用于专性***培养。常用的方法有抽气换气法和气体发生袋法。
1)抽气换气法:将已接种的培养基放入真空干燥缸或厌氧罐中,再放入催化剂钯粒和指示剂美蓝。先用真空泵将缸内抽成负压99.99kPa(750mmHg),再充入无氧氮气,反复三次,*后充入80%N2、10%H2和10%CO2混合气体,若缸内呈无氧状态,则指示剂美蓝为无色。每次观察标本后需重新抽气换气,用过的钯粒经160℃2h干烤后可重复使用。
2)气体发生袋法(Gas-pak法):该法需以下二种容器:厌氧罐——是由透明聚碳酸酯或不锈钢制成,盖内有金属网状容器,其内装有厌氧指示剂美蓝和用铝箔包裹的催化剂钯粒;气体发生袋——是一种铝箔袋,其内装有硼氢化钠-氯化钴合剂、碳酸氢钠-柠檬酸合剂各1丸和1张滤纸条,使用时剪去特定部位,注入10ml水,水沿滤纸渗入到二种试剂中,发生下列化学反应,产生H2和CO2。立即将气体发生袋放入罐内,密封罐盖,使气体释放到罐中。
C6H8O7+3NaHCO3→Na3(C6H5O7)+3H2O+3CO2↑
NaBH4+2H2O→NaBO2+4H2↑
(2)厌氧袋法:厌氧袋是用无毒透明、不透气的复合塑料薄膜制成。袋中装有催化剂钯粒和2支安瓿,分别装有H2、CO2发生器(化学药品,成分同上)、指示剂美蓝。使用时将接种**的平板放入袋中,密封袋口,先将袋中装有化学药品的安瓿折断,几分钟后再折断装有美蓝的安瓿,若美蓝为无色则表示袋内已处于无氧状态,置35℃温箱孵育。
(3)需氧菌共生法:将已知专性需氧菌(如枯草芽胞杆菌)和待检***分别接种到2个大小相同的平板上,将两者合拢,缝隙用透明胶密封,置35℃温箱培养,需氧菌生长过程中消耗氧气,待氧气耗尽后,***即开始生长。
(4)平皿焦性没食子酸法:按每100ml容积加入焦性没食子酸1g和2.5mol/LNaOH 10ml(也可用Na2CO3)的比例,先将焦性没食子酸放入平皿盖背面的**纱布中,再滴入NaOH,立即将接种**的平板扣上,用熔化的石蜡密封平皿和平皿盖的缝隙,置35℃温箱培养。
(5)庖肉培养基法:将庖肉培养基上面的石蜡熔化,用毛细管吸取标本后接种于培养基中,待石蜡凝固后置37℃孵育。用于培养基中的肉渣可吸收氧气,石蜡凝固后起隔绝空气的作用,从而使培养基内呈无氧状态。
(6)厌氧手套箱培养法:厌氧手套箱是目前国际上公认的培养****佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱,箱的前面有一个透明面板,板上装有两个手套,可通过手套在箱内进行操作。箱侧有一交换室,具有内外二门,内门通箱内先关着。使用时将物品放入箱内,先打开外门,放入交换室,关上外门进行抽气、换气(H2,CO2,N2)使之达到厌氧状态,然后手伸入手套把交换室内门打开,将物品移入箱内,关上内门。箱内保持厌氧状态,是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度,本身是孵箱或将孵箱附在其内。该法适于作***的大量培养研究。
四、**生长现象的观察
1.液体培养基中的生长现象:
浑浊生长(如葡萄球菌)、沉淀生长(如链球菌)、菌膜生长(如枯草杆菌)。
观察要点:注意观察培养基的透明度、管底和液面上是否有**生长。
2.半固体培养基中的生长现象:
(1)无鞭毛的**:仅沿穿刺线生长,穿刺线清晰,周围培养基透明(如葡萄球菌)。
(2)有鞭毛的**:沿穿刺线向四周扩散生长,穿刺线边缘呈羽毛状,周围培养基变浑浊(如大肠埃希菌)。
观察要点:注意观察穿刺线是否清晰、周围的培养基是否混浊。
3.固体培养基中的生长现象:
菌落:由一个**生长繁殖而形成的一个肉眼可见的**集团。因来源相同,同一个菌落的**为纯种**。不同**菌落的形态学特征不同,可以鉴别**。
菌苔:由多个菌落融合而成,可能含有杂菌。
菌落性状的描述:大小、形状、颜色、凸扁、表面光滑度、湿润度、光泽、透明度、边缘、粘度、溶血(血平板)、气味等。
【结果记录和报告】
**的接种培养法与生长现象的观察
**的接种培养法与生长现象的观察